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Fluorophores et Filtres pour la Microscopie à Fluorescence
Edmund Optics Ltd

Fluorophores et Filtres pour la Microscopie à Fluorescence

Un fluorophore (ou fluorochrome) est une sorte de colorant fluorescent utilisé pour tracer les protéines, les tissus et les cellules avec un marqueur fluorescent pour leur examen ultérieur par microscopie à fluorescence. Un fluorophore fonctionne en absorbant l'énergie d'une région de longueur d'onde spécifique, communément appelée la plage d'excitation, et en ré-émettant cette énergie dans une autre région de longueur d'onde spécifique, communément appelée la plage d'émission.

A Generalized Fluorophore Spectral Curve
Figure 1: Courbe spectrale généralisée de fluorescence

En général, un fluorophore est excité (ou absorbe l'énergie) par une illumination haute fréquence (longueurs d'onde dans l'ultraviolet, ou la région du violet et du bleu du spectre), et émet de l'énergie à des fréquences légèrement inférieures (longueurs d'onde dans la région du vert, rouge, ou NIR du spectre). Chaque fluorophore possède une longueur d'onde à laquelle il absorbe de l'énergie plus efficacement, cette longueur d'onde est désignée dans notre tableau de filtres interactifs comme le Pic d'Excitation λ (nm), et une longueur d'onde correspondante à laquelle la quantité maximale d'énergie absorbée est réémise, et qui est indiquée dans notre tableau de filtres interactifs, comme le Pic d'Emission λ (nm). La sélection de filtres optiques individuels, ayant une quantité de transmission maximale à chacune de ces longueurs d'onde, garantira des images fluorescentes lumineuses.

Une configuration de microscope à fluorescence type utilisée dans les applications de microscopie à fluorescence, se compose de trois filtres. Reportez-vous à la Figure 2 pour une configuration type.

FILTRE N° 1 : FILTRE D'EXCITATION

Le filtre d'excitation est placé dans le rayon d'éclairement d'un microscope à fluorescence. Son but est de filtrer l'ensemble des longueurs d'onde de la source de lumière, à l'exception de la plage d'excitation du fluorophore sous inspection. Le pourcentage minimum de transmission du filtre déterminera la luminosité et la brillance des images. Edmund Optics recommande une transmission minimum de 40 % pour tout filtre d'excitation, avec une transmission idéale supérieure à 85 %. La largeur de bande du filtre d'excitation doit reposer entièrement dans la plage d'excitation du fluorophore, le filtre idéal ayant une longueur d'onde centrale (CWL) se rapprochant le plus possible du pic d'excitation du fluorophore en question. La densité optique (OD) du filtre d'excitation déterminera l'opacité de l'image de fond, étant donné que la densité optique est une mesure de la façon dont un filtre bloque les longueurs d'onde en dehors de sa bande passante. Edmund Optics recommande une densité optique minimale de 3.0 avec une densité optique idéale de 6.0. Un filtre optique de combinaison idéale entre longueur d'onde centrale, transmission minimale et densité optique, fournira les images les plus claires qui soient, avec un blocage le plus profond possible, en veillant à la détection des signaux d'émission les plus faibles.

A Typical Fluorescence Microscope Setup
Figure 2: Configuration type de microscope à fluorescence

FILTRE N° 2 : FILTRE D'ÉMISSION

Le filtre d'émission est placé dans le rayon d'éclairement d'un microscope à fluorescence. Il a pour but de filtrer toute la plage d'excitation du fluorophore en cours d'inspection, et de transmettre la plage d'émission de ce fluorophore. Les recommandations se rapportant à la transmission minimale, la bande passante, la densité optique, et la longueur d'onde centrale pour les filtres d'excitation, sont vraies pour les filtres d'émission. Encore une fois, un filtre d'émission ayant une combinaison idéale entre longueur d'onde centrale, transmission minimale et densité optique fournira les images les plus claires qui soient, avec le blocage le plus profond possible, en veillant à la détection des signaux d'émission les plus faibles.

FILTRE N° 3 : FILTRE DICHROIQUE OU SÉPARATEUR

Le filtre dichroïque ou séparateur est placé entre le filtre d'excitation et le filtre d'émission, à un angle de 45°. Il a pour but de réfléchir le signal d'excitation vers le fluorophore en cours d'inspection, et de transmettre le signal d'émission vers le détecteur. Un filtre dichroïque ou séparateur idéal aura une transition nette entre la réflexion maximale et la transmission maximale, avec un pourcentage de réflexion supérieur à 95 % pour la bande passante du filtre d'excitation, et une transmission superieure à 90 % pour la bande passante du filtre d'émission. Le filtre doit être sélectionné en ayant la Longueur d'Onde d'Intersection (λ) du fluorophore en tête, pour assurer une lumière parasite minime et un rapport signal sur bruit maximum dans l'image fluorescente. La sélection d'un filtre dichroïque ou séparateur approprié étant délicate, laissez Edmund Optics vous aider à choisir le filtre optique approprié à votre application. Pour discuter de vos besoins, veuillez nous contacter.

How Does EO Match Filter Pairs?

DE QUELLE MANIÈRE EO ASSORTIT SES PAIRES DE FILTRES ?

Edmund Optics propose des dizaines de filtres optiques en stock, prêts à être expédiés et qui sont conformes à la région d'excitation ou d'émission de chacun des fluorophores spécifiés. Nous facilitons la recherche rapide des filtres par fluorophore. Il suffit de parcourir les filtres recommandés qui correspondent le mieux à la longueur d'onde longueur d'onde du pic d'excitation ou d'émission, avec la transmission maximale à cette longueur d'onde. Pour des applications de microscopie à fluorescence utilisant de nombreux fluorophores, des sources laser, d'autres filtres dichroïques ou séparateurs, ou des applications plus complexes que les configurations de microscope à fluorescence types,, contactez-nous pour discuter de vos spécifications.


Filtres Interférentiels d'Excitation/Émission Choisis à partir des Familles de Filtres

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Apprenez comment créer un montage de microscopie de fluorescence avec une illumination in-line et un filtrage pour optimiser le contraste et quantifier les émissions.

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