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SCIENCES DE LA VIE ET DISPOSITIFS MÉDICAUX

IMAGERIE PAR FLUORESCENCE
 

L’optique au service de l'imagerie par fluorescence

L'imagerie par fluorescence est une technique puissante, très sensible et non invasive utilisée dans les sciences de la vie pour visualiser et surveiller les processus biologiques dans des cellules vivantes ou fixées, des tissus ou même des organismes complets. La fluorescence est l'émission d'un rayonnement, visible ou invisible, par une substance telle qu'un colorant fluorescent (également appelé fluorophore ou chromophore), après excitation par la lumière ou un autre rayonnement électromagnétique. Il existe une large gamme de colorants et de protéines fluorescents disponibles dans le commerce qui peuvent être utilisés pour marquer les structures biologiques avec une grande spécificité. Les techniques d'imagerie par fluorescence peuvent être divisées en méthodes de fluorescence spectroscopique et microscopique. Les applications basées sur la détection spectrale comprennent la qPCR, le séquençage de l'ADN, le criblage à haut débit ou la cytométrie en flux. Les techniques de microscopie à fluorescence couramment utilisées dans les laboratoires de recherche biomédicale comprennent l'épifluorescence, la microscopie confocale, multiphotonique, TIRF (fluorescence à réflectance interne totale), à super-résolution (SIM, STORM, PALM, STED) ou à nappe de lumière, ainsi que l'imagerie en temps de vie de fluorescence. La technique la plus appropriée dépendra de multiples facteurs, dont le niveau de résolution bidimensionnelle ou tridimensionnelle, la vitesse d'imagerie, la profondeur d'imagerie ou le nombre de canaux de couleur requis, mais toutes utilisent le même mécanisme de fluorescence pour observer les processus biologiques.

Un système d'imagerie par fluorescence typique se compose des éléments suivants :

  • Source d'excitation : il peut s'agir d'une source à large bande ou d'une source à bande étroite, comme une LED ou un laser
  • Composants optiques pour la collecte, la direction et la séparation de la lumière : lentilles, miroirs, prismes, filtres optiques
  • Détecteur : c'est-à-dire une photodiode, un tube photomultiplicateur, une caméra CCD ou CMOS

Les jeux de filtres de fluorescence sont particulièrement importants pour séparer la lumière d'excitation de la fluorescence émise et consistent généralement en une combinaison d'un filtre d'excitation (généralement passe-bande), d'un filtre dichroïque (parfois appelé miroir dichroïque ou séparateur de faisceau dichromatique) et d'un filtre d'émission (passe-bande ou passe-haut) avec des profils de transmission optimisés pour correspondre aux caractéristiques spectrales de certains fluorophores.

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Le sang et l'optique

La microscopie confocale à fluorescence – Vue d'ensemble et trajet de faisceau typique

La microscopie à fluorescence est l’une des principales techniques utilisées pour étudier la dynamique fonctionnelle ou morphologique des structures synaptiques, notamment les épines dendritiques et les terminaux axonaux, et pour définir la connectivité et la dynamique des circuits. Un faisceau laser est généralement focalisé dans un orifice, agissant comme une source d'illumination ponctuelle. La lumière ainsi filtrée spatialement est réfléchie par un filtre dichroïque, ce qui peut nécessiter ou non un expanseur de faisceau permettant de remplir toute l’ouverture de l’objectif. L’objectif focalise alors l’énergie d’excitation sur l’échantillon qui émet un signal de fluorescence plus faible collecté par le même objectif. Cette lumière d’émission est transmise au travers du filtre dichroïque dans la seconde lentille tube et traverse ensuite un dernier orifice avant d’être détectée par un capteur CCD ou CMOS. Idéalement, les deux orifices sont situés dans des plans d’image conjugués sur l’axe optique, ce qui permet aux images de se chevaucher parfaitement sur le plan objet. Comme les microscopes confocaux observent un très petit point dans le plan de l’objet, il est important d’échantillonner la lumière via un système de balayage ou un actuateur motorisé permettant de collecter plusieurs images. Ces images sont ensuite reconstruites en images 2D ou 3D.

Cytométrie en flux
Figure 1 : Schéma de filtrage optique de base pour la microscopie à fluorescence

D’autres techniques de diagnostic basés sur l'optique

De nombreuses techniques de diagnostic optique sont utilisées pour examiner, diagnostiquer et traiter les affections médicales, par exemple du cerveau, notamment la microscopie à base de laser et l'optogénétique.

GFP

La protéine fluorescente verte (GFP) est une protéine spécialisée constituée d’un groupe spécifique d’acides aminés qui émettent une lumière verte lorsqu’ils sont exposés à la lumière UV ou bleue. Extraite de la vie marine, la longueur d’onde d’excitation la plus courante s’étend de 395 nm à 475 nm, avec des pointes d’émission allant de 509 à 525 nm. La GFP est énormément utilisée dans les systèmes d’imagerie par fluorescence non invasifs pour détecter les croissances tumorales, l’apoptose et d’autres activités cellulaires.

Optogénétique

Technique biologique qui consiste à utiliser la lumière pour contrôler les cellules dans des tissus vivants, plus particulièrement les neurones dans la plupart des cas ayant été génétiquement modifiés par des photorécepteurs qui réagissent à différentes bandes de longueur d'onde.

CLARITY

Méthode de rendre des tissus cérébraux transparents à l’aide d’hydrogels. Accompagnée d’anticorps ou biomarqueurs, cette méthode permet de prendre et étudier des images de structure nucléique du cerveau hautement détaillées.

GCaMP

Un marqueur calcique encodé génétiquement, utilisé dans l’imagerie cérébrale. GCaMP est semblable à la fusion d’une protéine fluorescente verte (GFP), de la calmoduline et d’une séquence peptidique dans la myosine.

Cartographie du cerveau

Technique de neuroscience conçue pour cartographier et répertorier les quantités ou propriétés spécifiques du cerveau dans une représentation spatiale. En d’autres termes, l’anatomie et la fonction du cerveau, de la colonne vertébrale au système nerveux central par des techniques d’imagerie.

Patch Clamp

Technique d’électrophysiologie permettant d’étudier les canaux ioniques simples et multiples dans les neurones, les cardiomyocytes, les fibres musculaires et d’autres cellules.

Microscopie laser

Les techniques de microscopie telles que la microscopie de fluorescence, confocale, multiphotonique et à super-résolution sont utilisées pour étudier des synapses, des neurones et des circuits neuronaux dans les tranches de cerveau.

Techniques de diagnostic

Un coup d'œil sur les produits

Les objectifs multi-éléments sont essentiels pour toute technique de microscopie, notamment de nombreuses techniques de diagnostique du cerveau. La compréhension des différents types d’objectifs est importante pour veiller à ce que vous utilisiez l’objectif approprié à votre application.

Objectifs Conjugués Finis

Objectifs Conjugués Finis

Ce sont des objectifs de microscope qui ne nécessitent pas une lentille secondaire pour focaliser sur un échantillon. Ils sont généralement optimisés pour une utilisation dans le spectre visible et contiennent jusqu’à quatre éléments.

Figure 2 : Modèle d’objectif de microscope conjugué fini

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Understanding Microscopes and Objectives

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Objectifs Corrigés à l'Infini

Objectifs Corrigés à l'Infini

Il s'agit d'objectifs de microscope qui focalisent à ​​l'infini. Les Objectifs Corrigés à l'Infini offrent de longues distances de travail, avec la possibilité de placer des composants optiques tels que des lentilles optiques ou des filtres optiques dans le chemin optique. Les Objectifs Corrigés à l’Infini présentent des résolutions plus élevées que les Objectifs à Conjugaison Finie, mais sont plus lourds et plus chers.

Figure 3 (à gauche) : Modèle d’objectif de microscope conjugué à l’infini (corrigé à l’infini)

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Understanding Microscopes and Objectives

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Comprendre l'objectif corrigé à l'infini, le pouvoir de résolution et le grossissement

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Using Tube Lenses with Infinity Corrected Objectives

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Objectifs Réfléchissants

Objectifs Réfléchissants

Les Objectifs Réfléchissants sont des objectifs de microscope qui utilisent deux miroirs pour former une image ou focaliser un laser dans des applications de microscopie requérant une correction chromatique sur de larges plages spectrales.

Figure 4 : Anatomie d’un objectif réfléchissant

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Understanding Microscopes and Objectives

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Icône d'article technique

Introduction aux objectifs réfléchissants

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Demanding Applications Call for Reflective Objectives

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Objectifs Achromatiques

Objectifs Achromatiques

Les Objectifs Achromatiques sont des objectifs de microscope qui corrigent l’aberration chromatique dans les longueurs d’onde rouges et bleues et l’aberration sphérique dans la longueur d’onde verte. Les Objectifs Achromatiques sont plus légers et moins chers que les Objectifs Apochromatiques mais leur correction n’est pas aussi importante pour l’aberration chromatique, l’aberration sphérique et la planéité du champ.

Figure 5 : Modèle d’objectif apochromatique (à gauche) contre modèle d’objectif achromatique (à droite)

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Understanding Microscopes and Objectives

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Objectifs Apochromatiques

Objectifs Apochromatiques

Les Objectifs Apochromatiques sont des objectifs microscopiques qui présentent une meilleure correction des couleurs que les Objectifs Achromatiques sur une large gamme de longueurs d’onde (VIS à IR proche), ainsi qu’une meilleure correction sphérique et une meilleure planéité de champ. Cependant, ils sont plus lourds et plus chers que les Objectifs Achromatiques.

Figure 6 : Modèle d’objectif apochromatique (à gauche) contre modèle d’objectif achromatique (à droite)

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Understanding Microscopes and Objectives

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Microscopie de fluorescence : Illumination en ligne avec filtres d'imagerie

En savoir plus sur la façon d’assembler un système de microscopie à fluorescence.

Calculateur de longueur de tube conjugué à l’infini

Déterminez la longueur maximale de tube dans un système de microscope conjugué à l’infini pour couvrir une dimension de capteur d’image spécifique sans vignettage, en utilisant la focale de l’objectif, l'ouverture numérique de l’objectif, le diamètre de la pupille d’entrée et la focale de la lentille tube et la taille du capteur.

Les maladies du cerveau

Les maladies courantes du cerveau, détectées par des techniques de diagnostic avancées telles que la microscopie à fluorescence, sont répertoriées ci-dessous. Les avancées dans les objectifs de microscope et d’autres composants optiques permettent à ces maladies d’être plus facilement détectées et traitées.

Apoplexie

Une affection médicale qui survient lors d’une interruption prolongée de l’irrigation sanguine du cerveau entraînant une faiblesse musculaire d’un côté du corps, une perte de contrôle du visage, un engourdissement et des problèmes d’élocution.

Maladie d'Alzheimer

Un type de démence progressive et incurable qui détruit la mémoire et d’autres fonctions mentales

Maladie de Parkinson

Une maladie incurable du système nerveux central (SNC) qui affecte le mouvement et inclut des tremblements incontrôlables.

Maladie de Huntington

Une maladie héréditaire, incurable qui entraîne la décomposition des cellules nerveuses du cerveau au fil du temps, entraînant des mouvements corporels saccadés et éventuellement l’incapacité de parler.

Méningite

Une inflammation grave du cerveau et des membranes de la moelle épinière qui est généralement déclenchée par une infection et entraîne de la fièvre, des maux de tête et une raideur du cou.

Épilepsie

Un état caractérisé par des crises récurrentes principalement dues à une activité électrique anormale et accrue dans le cerveau.

Commotion cérébrale

Le type le plus courant de lésion cérébrale traumatique qui se manifeste par un impact important résultant en une secousse du cerveau ou un déplacement à l’intérieur du crâne.

Tumeurs au cerveau

Des tumeurs cancéreuses ou non cancéreuses de cellules anormales dans le cerveau ayant différents niveaux et types de gravité, notamment l’astrocytome, le blastome, l’épendymome et le méningiome.

 
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