L’application optique de la microscopie à fluorescence

Auteurs : Stephan Briggs

La microscopie à fluorescence est une technique optique de microscopie qui utilise la fluorescence induite par des fluorophores, par opposition à l'absorption, la diffusion ou la réflexion. Un fluorophore est un colorant fluorescent utilisé pour marquer des protéines, des tissus et des cellules afin de les examiner par microscopie à fluorescence. Un fluorophore fonctionne en absorbant l'énergie de longueurs d'onde spécifiques, communément appelées la gamme d'excitation, et en réémettant cette énergie dans une autre région de longueurs d'onde spécifique, appelée la gamme d'émission.

Les systèmes de microscopie à fluorescence peuvent être très simples, comme un microscope à épifluorescence, ou extrêmement complexes, comme les systèmes confocaux ou multiphotoniques. Qu'ils soient simples ou complexes, les microscopes à fluorescence partagent le même concept de base : l'énergie d'excitation est utilisée pour éclairer un échantillon qui émet alors un type d'énergie de longueur d'onde, bien que faible, qui est quantifiable. Les longueurs d'onde d'excitation et d'émission ne partagent pas la même longueur d'onde centrale, ce qui permet aux filtres optiques spécialisés d'augmenter le contraste global et le signal.

Apparence de l'image

La figure 1 montre un échantillon de fluorescence réel. L'échantillon est excité par une source de courte longueur d'onde (350 - 500 nm), puis émet une longueur d'onde fluorescente supérieure à la longueur d'onde d'excitation (500 nm +). De telles images ne pourraient être capturées sans les techniques de filtrage optique avancées de la microscopie à fluorescence, qui permettent à des bandes passantes étroites de lumière de se propager jusqu'au capteur, ce qui permet d'obtenir des images très nettes et très contrastées. Les protéines fluorescentes présentes dans les échantillons sont à l'origine des couleurs d'émission uniques. Ces protéines, comme la GFP, sont souvent dérivées de la vie marine.

Figure 1 : Image de fluorescence de microsphères

Détails techniques

En général, les détails techniques d'un microscope à fluorescence correspondent à n'importe quel microscope à éclairage à fond clair ou microscope à éclairage à fond noir standard. L'innovation réside dans les techniques de filtrage complexes qui permettent d'utiliser de manière sélective des bandes étroites de lumière. Les trois filtres essentiels pour un microscope à fluorescence de précision sont les filtres d'excitation, les filtres dichroïques et les filtres d'émission. Pour des informations plus approfondies, veuillez lire Fluorophores et filtres pour la microscopie à fluorescence.

1. Filtre d'excitation : placé dans le trajet d'éclairage d'un microscope à fluorescence. Il filtre toutes les longueurs d'onde de la source lumineuse à l'exception de la gamme d'excitation du fluorophore ou de l'échantillon inspecté.
2. Filtre dichroïque : placé entre le filtre d'excitation et le filtre d'émission à un angle de 45°. Il réfléchit le signal d'excitation vers le fluorophore inspecté et transmet le signal d'émission vers le détecteur.
3. Filtre d'excitation : placé dans le trajet d'éclairage d'un microscope à fluorescence. Il filtre toute la gamme d'excitation du fluorophore examiné et transmet la gamme d'émission du fluorophore.

Figure 2 : Schéma de filtrage optique de base pour la microscopie à fluorescence

Les autres applications de la microscopie optique comprennent l'éclairage à fond clair, l'éclairage à fond noir, le contraste de phase et le contraste interférentiel différentiel.