Microscopie à Fluorescence : Illumination In-Line avec Filtres d'Imagerie

Auteurs : Stephan Briggs

Configuration de base | Composant Suggérés

Les progrès technologiques en terme de caméra d'imagerie ont révolutionné la microscopie dans les applications biologiques et industrielles. Les biologistes ou les ingénieurs n'ont plus besoin de passer des heures pénibles à regarder au travers d'oculaires, en réglant constamment la mise au point. De nos jours, la simplification de l'enregistrement et de l'analyse des données se fait avec des systèmes de microscopes vidéo numériques. Pour obtenir des informations générales sur ce type de système, veuillez consulter le document sur les Configurations de l'Objectif de Microscope Vidéo Numérique.

Pour vraiment voir les avantages d'un système de microscope vidéo numérique, imaginez un système utilisant une illumination in-line et un filtrage pour obtenir un contraste optimal et pour quantifier les émissions.

LES BASES DE LA MICROSCOPIE À FLUORESCENCE

La microscopie à fluorescence est idéale pour mesurer et analyser l'absorption et l'excitation de différentes longueurs d'onde de lumière. Une configuration de microscopie à fluorescence in-line utilise une lame séparatrice pour rediriger la lumière d'un illuminateur vers un chemin optique parallèle. D'un point de vue mécanique, cette configuration est moins complexe que d'autres systèmes de microscopes vidéo numériques et se rapproche de la Figure 1. Comme la plupart des systèmes optiques, ce système comporte un capteur, un composant optique, et un objet en cours d'inspection. Dans cet exemple, une caméra USB couleur CMOS EO-3112C ½" #59-367 est utilisée comme capteur, en plus d'un Objectif 10X EO M Plan Apo Corrigé à l'Infini #59-877 et un Accessoire de Lentille Tube MT-1 #54-774 pour les composants optiques. #54-774 est un accessoire de lentille requis pour former une image à partir de l'objectif corrigé à l'infini. L'objet à inspecter peut inclure des éléments tels que des échantillons biologiques, des plantes ou des insectes, des matériaux en verre ou en métal et des cibles.

Figure 1: Système de Microscope Vidéo Numérique Corrigé à l'Infini à Sept Composants, pour la Microscopie à Fluorescence

Le choix de filtres optiques est important lors de la sélection des longueurs d'onde d'excitation et d'émission dans le système de microscope vidéo numérique de la Figure 1. Après avoir ajouté les filtres optiques, ce type de système est communément appelé microscope à fluorescence (Figure 2). Il correspond au pilier des techniques les plus avancées telles que la microscopie confocale, multiphotonique, et à diffusion Raman anti-stokes cohérente. Pour des informations détaillées sur le type de filtres optiques, veuillez consulter le document sur les Fluorophores et Filtres pour la Microscopie à Fluorescence.

Le blocage de certaines longueurs d'onde permet de concentrer une énorme quantité de lumière sur un échantillon. Les échantillons étant généralement imagés sous un microscope à fluorescence ils nécessitent une grande quantité d'énergie d'excitation pour émettre une quantité notable de lumière. Les filtres à haute résistance à fortes densités optiques et les filtres dichroïques bloquent certaines longueurs d'onde rapidement et facilement. Les filtres dichroïques et d'émission sont les deux filtres les plus cruciaux du système. Le filtre dichroïque réfléchis des longueurs d'onde basses qui généralement excitent les fluorophores, et il transmet les longueurs d'onde plus hautes qui sont alors émises. Ensemble, ces filtres optiques empêchent l'énergie sans émission et la lumière parasite d'atteindre le capteur. Les paramètres importants d'un filtre incluent la longueur d'onde centrale (CWL), le pourcentage de transmission minimum, la densité optique (OD), et la largeur de bande qui est également appelée largeur de bande à mi-hauteur (FWHM). Pour de plus amples informations sur les filtres, veuillez lire les Filtres Optiques.

Figure 2: Dispositif de Filtrage Optique de Base pour la Microscopie à Fluorescence

COMPOSANTS OPTIQUES ET MÉCANIQUES

Il existe une grande variété de composants optiques, d´imagerie, et de positionnement nécessaires pour créer un système de microscopie à fluorescence de précision. Pour simplifier autant que possible le processus de sélection, le Tableau 1 comprend une liste complète des composants (connue sous le nom de nomenclature) détaillant les produits proposés, leurs numéros de stock et leurs quantités.

La Figure 3 illustre une configuration en situation réelle, avec des produits du Tableau 1. De haut en bas, le montage commence par la Caméra USB Couleur CMOS EO-3112C ½" #59-367 et se poursuit par des adaptateurs de monture C #58-329 et #55-743 qui se connectent à l'Accessoire de Lentille Tube MT-1 #54-774. L'espace se trouvant après la lentille tube et avant l'objectif constitue le chemin optique parallèle, qui est l'avantage d'un système corrigé à l'infini. Ce chemin optique permet l'introduction de composants optiques sans distorsion ou aberration. Dans la Figure 3, l'Assemblée de Roue de Filtres à 6 Positions #56-658 contient un certain nombre de filtres d'émission passe-bande, et un séparateur dichroïque qui réfléchit la lumière blanche vers le bas pour obtenir une illumination in-line et transmet au capteur la lumière traversée par l'objectif. Pour finir, l'Objectif 10X EO M Plan Apo Corrigé à l'Infini, #59-877 accompagné d'une série de composants mécaniques apporte un meilleur réglage de l'échantillon. La Figure 4 présente une meilleure visualisation de l'assemblée de roue de filtres et de son emplacement après la lentille tube.

Figure 3: Configuration d'un Microscope à Fluorescence

Figure 4: Assemblée de Roue de Filtres avec Filtres Montrés présentés dans le Chemin Optique

Les systèmes de microscope vidéo numérique sont de puissants outils optiques permettant d'inspecter des échantillons industriels et biologiques. Les systèmes peuvent être aussi simples ou aussi complexes que possible comprenant de quatre composants à plus de douze. Les systèmes utilisant plus de douze composants possèdent généralement des méthodes de filtrage complexes et des éléments mécaniques sont nécessaires pour placer les filtres optiques dans le chemin optique. Lorsque il est nécessaire d'ajouter des composants optiques dans le chemin optique du système de caméra-objectif, le système à sept composants corrigé à l'infini, reste le choix idéal, en particulier dans les applications de microscopie à fluorescence.